绿色无毒安全核酸染料MIDORI Green Xtra用于CRISPR / Cas9实验

CRIPR / CAS系统已被用作遗传修饰的工具已有好几年了。细菌Cas9核酸酶在称为PAM（proto-spacer adjacent motifs）的DNA中产生双链断裂，该PAM是基因组中重复的三核苷酸区域。借助合成RNA序列（引导RNA），可以有针对性地修饰DNA中的区域。

双链断裂通过细胞自身的修复机制修复，例如非同源重组末端连接（NHEJ）和同源直接重组（HDR）。 NHEJ在DNA中产生随机插入或缺失，从而阻止了正确的蛋白质生产。 HDR在正确的背景下插入DNA序列，从而可以有针对性地修饰蛋白质生产或蛋白质。但是，在这种情况下，通过同源直接修复（HDR）进行修饰的效率明显低于通过NHEJ意外插入和缺失的情况。可以通过使用两个sgRNA，在G2 / M中停止细胞周期并添加ssODN（ss寡聚供体）来提高效率，在本文献中也对所有选项进行了测试。

本文研究了CRIPR / Cas9反应对TNFα的效率。 TNFα调节许多生物过程，可引起类风湿性关节炎等疾病，并且还参与肿瘤的发生和发展。

T7EI核酸酶测定法用于双链断裂的效率分析。 HDR效率可以通过用SmaI消化来检查，因为SmaI切割区域已集成到HDR中。

为了进行凝胶分析，琼脂糖用Midori Green Xtra染色。该染料是一种超灵敏的非致癌性和无毒的核酸染料，非常适合用于蓝色或蓝色/绿色LED灯的检测。敏感性和准确度与在致癌性EtBr染色的凝胶中一样好。

这样即使在信号较弱的情况下也可以检测到非常清晰的条带。通过Midori Green Xtra凝胶染色可以很好地计算HDR效率，因为这种染料非常适合定量。 

原始文献

Systematic analysis of factors that improve homologous direct repair (HDR) efficiency in CRISPR/Cas9 technique

Paper: PLOS ONE, March 5, 2021, M. Di Stazio et al. (论文链接)